免疫組化是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究。

實(shí)驗(yàn)步驟Experimental Procedure

01脫蠟水化：

脫蠟水化：將切片放入切片架中，于烘箱中烘烤進(jìn)行脫蠟，然后迅速將帶有組織切片的切片架按順序置于二甲苯 I 、二甲苯 II 、二甲苯 III 、無水乙醇I 、無水乙醇 II 、95%乙醇、85% 乙醇、75%乙醇 、50%乙醇中浸泡，最后用超純水再浸泡。

思科捷實(shí)驗(yàn)平臺根據(jù)客戶的樣本類型和抗體類型選擇不同抗原修復(fù)液和抗原修復(fù)方式，包括熱修復(fù)（微波修復(fù)、水浴鍋修復(fù)）和酶修復(fù)。下圖展現(xiàn)的是微波修復(fù)-修復(fù)液漫過切片，將燒杯放入微波爐中，高火煮沸改至中火計(jì)時 15 min（組織不同、 固定時間不同，修復(fù)時間也不同）。

將內(nèi)源性過氧化物酶封閉液滴加到切片上，室溫封閉 10 min 去除內(nèi)源性過氧化物酶，再用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。

將封閉液（根據(jù)二抗決定）滴加到切片上，將切片連同濕盒一起放置于恒溫箱中孵育，然后甩去封閉用的封閉液。

滴加按照相應(yīng)比例稀釋的一抗，記錄好一抗?jié)舛?，將切片放在濕盒中?4℃冰箱中過夜孵育，過夜孵育后的切片先恢復(fù)至室溫，再用 PBS清洗。

滴加適當(dāng)比例稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，將切片放在濕盒中進(jìn)行室溫孵育，待孵育結(jié)束后，再用 PBS 沖洗。

加入DAB工作液，開始計(jì)時。當(dāng)在顯微鏡下觀察到棕黃色的陽性表達(dá)時，立即用PBS緩沖液進(jìn)行終止顯色。

將切片置于玻片存放板上，取過濾后的蘇木素滴加到組織切片上，開始計(jì)時，待組織切片呈紫紅色結(jié)束計(jì)時，記錄染色時間(具體時間視染色結(jié)果和實(shí)驗(yàn)要求而定)。

染色后立即將存放板置于自來水水槽上進(jìn)行沖洗，將多余染料沖凈，再將鹽酸乙醇分化液滴加到組織切片上進(jìn)行分化，待組織由藍(lán)變紅，再用自來水沖洗組織返藍(lán)。

將染色后的切片放于切片架中，按順序依次置于 50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇浸泡、二甲苯II、二甲苯I中浸泡。

待切片晾干后置于存放板上，在組織上滴加中性樹膠封片劑，用蓋玻片進(jìn)行封片，將封好的組織切片放入通風(fēng)櫥中晾至無味。

（1）按照熒光顯微鏡使用規(guī)程進(jìn)行操作，將切片放于置物臺的卡槽里，在50 X 物鏡下找到組織所在位置，將物鏡調(diào)整到客戶所需倍數(shù)，調(diào)好焦距、 調(diào)好光亮度。

（2）調(diào)白平衡：在拍照位置調(diào)清晰后找到有中性樹膠封片劑的空白處，進(jìn)行白平衡。

（3）提取圖像：根據(jù)客戶要求找到目標(biāo)位置，再次調(diào)整焦距至清晰視野，點(diǎn)擊提取圖像完成拍照。

(1) 在正式實(shí)驗(yàn)之前，需進(jìn)行染色效果預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，以確定最佳的染色條件。

(2) 自來水沖洗時水流速度要小，并且水流不能直沖組織，避免造成組織脫離玻片或者沖散。

(3) 切片經(jīng)蘇木素復(fù)染后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封片，如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。

(4) 抗原修復(fù)方式由一抗決定，可以通過抗體說明書或案例中查到，也可以詢問抗體公司進(jìn)行確認(rèn)。

(5) 一抗孵育后，清洗切片時一定要單張切片，逐個進(jìn)行沖洗，多張切片用浸泡的方式同時進(jìn)行清洗，容易造成交叉污染； 溫柔沖洗，防止組織的脫落。

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