在細(xì)胞生物學(xué)與藥理學(xué)研究中，細(xì)胞增殖能力的評(píng)估是不可或缺的一環(huán)。其中，CCK-8 (Cell Counting Kit) 實(shí)驗(yàn)因操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且結(jié)果準(zhǔn)確可靠而備受青睞。

接下來讓星博士帶您深入了解 CCK-8 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵要點(diǎn)吧！

CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 的有效成分是 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽) ，是一種類似于 MTT (Thiazolyl Blue) 的化合物，它在電子耦合試劑 1-Methoxy PMS 存在條件下，可被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為橙色甲瓚產(chǎn)物 Formazan (具有高度水溶性) ，而生成的 Formazan 數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。

甲瓚產(chǎn)物在 450 nm 波長(zhǎng)下有最大的吸光度，因此通常使用酶標(biāo)儀檢測(cè)該波長(zhǎng)處的吸光度 (OD 值)，OD 值與細(xì)胞活力成正比，從而可進(jìn)行定量分析。

細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

藥敏實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖和毒性分析，特別適用于高通量篩選

制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。

可按比例 (如 1:2) 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般做 5-7 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組設(shè)置 3-6 個(gè)重復(fù)，96 孔板每孔加入 100 μL 細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置調(diào)零孔，孔內(nèi)加 100 μL 培養(yǎng)基 (不含細(xì)胞)。

培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，一般 2-4 小時(shí)即可。懸浮細(xì)胞或不需貼壁此步驟可省略。

每孔加 10 μL CCK-8 溶液，混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5-4 小時(shí)，測(cè)定酶標(biāo)儀 450 nm 處 OD 值。(細(xì)胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，絕大多數(shù)情況下孵育 1 小時(shí)即可。如果顯色程度不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)以確認(rèn)最佳條件)。

以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo) (X 軸) ，OD 值為縱坐標(biāo) (Y 軸) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)驗(yàn)條件一致時(shí)，可以根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)。

制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。

選擇合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，96 孔板每孔加入約 100 μL 細(xì)胞懸液，并設(shè)置重復(fù) (一般設(shè)置 3-6 個(gè)重復(fù))。

37 ℃ 培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí)。

每孔加 10 μL CCK-8 溶液，混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5-4 小時(shí)，并用酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm 處 OD 值 (細(xì)胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，在大多數(shù)情況下孵育 1 小時(shí)即可。如果顯色程度不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)以確認(rèn)最佳條件) 。

制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。

選擇合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔、對(duì)照孔及實(shí)驗(yàn)孔，空白孔內(nèi)加 100 μL 培養(yǎng)基 (不含細(xì)胞)，對(duì)照孔及加藥孔加入 100 μL 相同細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液，并設(shè)置重復(fù) (一般設(shè)置 3-6個(gè)重復(fù))。

37 ℃ 培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時(shí)，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求合理調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入 0-10 μL 不同濃度的待測(cè)藥物。置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育一段時(shí)間 (例如：6、12、24或 48 小時(shí)) ，具體孵育時(shí)間要根據(jù)藥物性質(zhì)及細(xì)胞敏感性 (一般由細(xì)胞周期決定，起碼要孵育一代以上的時(shí)間) 。

每孔加入 10 μL CCK-8溶液 (注意：若待測(cè)藥物有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 溶液前吸除培養(yǎng)基并用新的培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞兩次后再加入新的培養(yǎng)基，以去掉藥物影響) ，混勻，繼續(xù)孵育。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5-4 小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm 處 OD 值 (細(xì)胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，絕大多數(shù)情況下孵育 1 小時(shí)即可。如果顯色程度不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)以確認(rèn)最佳條件)。

細(xì)胞抑制率= (對(duì)照-實(shí)驗(yàn))/(對(duì)照-空白) ×100%

對(duì)照：具有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液的孔的OD值

實(shí)驗(yàn)：具有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值

空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的孔的OD值

為得到更佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在正式開始實(shí)驗(yàn)前，要做什么呢？

星博士為您整理了一些注意事項(xiàng)，請(qǐng)和星博士一起往下看吧：

(1) 先做預(yù)實(shí)驗(yàn)：

建議在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的細(xì)胞接種數(shù)量和 CCK-8 溶液加入后的最佳培養(yǎng)時(shí)間

(2) 注意液體蒸發(fā)：

一般使用 96 孔板進(jìn)行檢測(cè)，但如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，可能出現(xiàn)液體蒸發(fā)的情況。而96孔板外圍一圈最易蒸發(fā)，可棄用，改加 PBS，水或無血清培養(yǎng)基。同時(shí)，可以將孔板放置在培養(yǎng)箱內(nèi)靠近水源的位置，以減少液體蒸發(fā)。

(3) 試劑顏色不影響結(jié)果：

雖然培養(yǎng)基中的酚紅和 CCK-8 溶液顏色相近，但是在計(jì)算時(shí)，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

(4) 24孔板和12孔板均適用：

若使用 24 孔板或 12 孔板實(shí)驗(yàn)，可按孔內(nèi)培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

(5) 去除氧化還原物質(zhì)的影響：

如果待測(cè)體系中存在氧化還原物質(zhì)可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，還原性物質(zhì)會(huì)使吸光度增加，氧化性物質(zhì)會(huì)使吸光度減小，因此需要盡量去除這些物質(zhì)的影響。

(6) 濾光片的選擇：

若沒有 450 nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450 nm檢測(cè)靈敏度最高。如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng) 450 nm，參比波長(zhǎng)600-650 nm 。

(7) 加試劑小tip：

由于每孔加 CCK-8 溶液的量比較少，有可能因試劑粘在孔壁帶來誤差，可以加過試劑后輕敲混勻或直接配置含有 10% CCK-8 溶液的培養(yǎng)基，以換液形式加入。操作時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)影響最后的測(cè)定結(jié)果。

(8) 設(shè)置空白對(duì)照：

設(shè)置空白孔作為調(diào)零孔時(shí)，在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8 溶液，培養(yǎng)相同時(shí)間后以在 450 nm 處測(cè)定的吸光值作為空白對(duì)照。

在處理細(xì)胞時(shí)加入藥物，還應(yīng)考慮藥物的吸收。為此，可以在加入藥物的培養(yǎng)基中添加 CCK-8 溶液，并在培養(yǎng)相同時(shí)間后，在 450 nm 處測(cè)定吸光值作為空白對(duì)照。

PS：貨號(hào) CT0001，有100T；500T；500T*5；500T*20；500T*50多種規(guī)格哦!