在細胞生物學與藥理學研究中，細胞增殖能力的評估是不可或缺的一環(huán)。其中，CCK-8 (Cell Counting Kit) 實驗因操作簡便、靈敏度高且結果準確可靠而備受青睞。

接下來讓星博士帶您深入了解 CCK-8 實驗的關鍵要點吧！

CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 的有效成分是 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽) ，是一種類似于 MTT (Thiazolyl Blue) 的化合物，它在電子耦合試劑 1-Methoxy PMS 存在條件下，可被線粒體內的脫氫酶還原為橙色甲瓚產物 Formazan (具有高度水溶性) ，而生成的 Formazan 數量與活細胞數量成正比。

甲瓚產物在 450 nm 波長下有最大的吸光度，因此通常使用酶標儀檢測該波長處的吸光度 (OD 值)，OD 值與細胞活力成正比，從而可進行定量分析。

細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。

藥敏實驗，細胞增殖和毒性分析，特別適用于高通量篩選

制備細胞懸液并計數。

可按比例 (如 1:2) 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般做 5-7 個細胞濃度梯度，每組設置 3-6 個重復，96 孔板每孔加入 100 μL 細胞懸液。實驗設置調零孔，孔內加 100 μL 培養(yǎng)基 (不含細胞)。

培養(yǎng)至細胞貼壁，一般 2-4 小時即可。懸浮細胞或不需貼壁此步驟可省略。

每孔加 10 μL CCK-8 溶液，混勻，培養(yǎng)箱內孵育 0.5-4 小時，測定酶標儀 450 nm 處 OD 值。(細胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，絕大多數情況下孵育 1 小時即可。如果顯色程度不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)以確認最佳條件)。

以細胞數為橫坐標 (X 軸) ，OD 值為縱坐標 (Y 軸) 制作標準曲線。在實驗條件一致時，可以根據此標準曲線測定出未知樣品的細胞數。

制備細胞懸液并計數。

選擇合適的鋪板細胞數，用培養(yǎng)基稀釋細胞懸液，96 孔板每孔加入約 100 μL 細胞懸液，并設置重復 (一般設置 3-6 個重復)。

37 ℃ 培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 24 小時。

每孔加 10 μL CCK-8 溶液，混勻，培養(yǎng)箱內孵育 0.5-4 小時，并用酶標儀測定 450 nm 處 OD 值 (細胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，在大多數情況下孵育 1 小時即可。如果顯色程度不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)以確認最佳條件) 。

制備細胞懸液并計數。

選擇合適的鋪板細胞數，用培養(yǎng)基稀釋細胞懸液。實驗設置空白孔、對照孔及實驗孔，空白孔內加 100 μL 培養(yǎng)基 (不含細胞)，對照孔及加藥孔加入 100 μL 相同細胞濃度的細胞懸液，并設置重復 (一般設置 3-6個重復)。

37 ℃ 培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 24 小時，或根據實驗的不同要求合理調整培養(yǎng)時間。

實驗孔內加入 0-10 μL 不同濃度的待測藥物。置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育一段時間 (例如：6、12、24或 48 小時) ，具體孵育時間要根據藥物性質及細胞敏感性 (一般由細胞周期決定，起碼要孵育一代以上的時間) 。

每孔加入 10 μL CCK-8溶液 (注意：若待測藥物有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 溶液前吸除培養(yǎng)基并用新的培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞兩次后再加入新的培養(yǎng)基，以去掉藥物影響) ，混勻，繼續(xù)孵育。培養(yǎng)箱內孵育 0.5-4 小時，用酶標儀測定 450 nm 處 OD 值 (細胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，絕大多數情況下孵育 1 小時即可。如果顯色程度不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)以確認最佳條件)。

細胞抑制率= (對照-實驗)/(對照-空白) ×100%

對照：具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液的孔的OD值

實驗：具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值

空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的孔的OD值

為得到更佳的實驗結果，在正式開始實驗前，要做什么呢？

星博士為您整理了一些注意事項，請和星博士一起往下看吧：

(1) 先做預實驗：

建議在實驗前進行預實驗，以確定最佳的細胞接種數量和 CCK-8 溶液加入后的最佳培養(yǎng)時間

(2) 注意液體蒸發(fā)：

一般使用 96 孔板進行檢測，但如果細胞培養(yǎng)時間較長，可能出現液體蒸發(fā)的情況。而96孔板外圍一圈最易蒸發(fā)，可棄用，改加 PBS，水或無血清培養(yǎng)基。同時，可以將孔板放置在培養(yǎng)箱內靠近水源的位置，以減少液體蒸發(fā)。

(3) 試劑顏色不影響結果：

雖然培養(yǎng)基中的酚紅和 CCK-8 溶液顏色相近，但是在計算時，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

(4) 24孔板和12孔板均適用：

若使用 24 孔板或 12 孔板實驗，可按孔內培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

(5) 去除氧化還原物質的影響：

如果待測體系中存在氧化還原物質可能會干擾檢測結果，還原性物質會使吸光度增加，氧化性物質會使吸光度減小，因此需要盡量去除這些物質的影響。

(6) 濾光片的選擇：

若沒有 450 nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450 nm檢測靈敏度最高。如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長 450 nm，參比波長600-650 nm 。

(7) 加試劑小tip：

由于每孔加 CCK-8 溶液的量比較少，有可能因試劑粘在孔壁帶來誤差，可以加過試劑后輕敲混勻或直接配置含有 10% CCK-8 溶液的培養(yǎng)基，以換液形式加入。操作時注意不要產生氣泡，氣泡會影響最后的測定結果。

(8) 設置空白對照：

設置空白孔作為調零孔時，在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8 溶液，培養(yǎng)相同時間后以在 450 nm 處測定的吸光值作為空白對照。

在處理細胞時加入藥物，還應考慮藥物的吸收。為此，可以在加入藥物的培養(yǎng)基中添加 CCK-8 溶液，并在培養(yǎng)相同時間后，在 450 nm 處測定吸光值作為空白對照。

PS：貨號 CT0001，有100T；500T；500T*5；500T*20；500T*50多種規(guī)格哦!